脊髓损伤模型大鼠鞘内注射甲基强的松龙后的蛋白质组学变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (49): 7897-7902.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.005

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脊髓损伤模型大鼠鞘内注射甲基强的松龙后的蛋白质组学变化

杨贝贝¹，陈江涛²，宋兴华²

¹新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆医科大学第一附属医院骨肿瘤科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2014-09-09 出版日期:2014-11-30 发布日期:2014-11-30
通讯作者: 宋兴华，博士后，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院骨肿瘤科科主任，主任医师，新疆医科大学第一附属医院骨肿瘤科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:杨贝贝，男，1988年生，河南省漯河市人，汉族，新疆医科大学研究生学院在读硕士，主要从事骨肿瘤，软组织肿瘤及骨病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81160218/H0605)“不同时间点鞘内注射甲基强的松龙治疗大鼠急性脊髓损伤的蛋白组学实验研究”

Proteome changes in a rat model of spinal cord injury after intrathecal injection of methylprednisolone

Yang Bei-bei¹, Chen Jiang-tao², Song Xing-hua²

¹First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Departmenet of Bone Tumor, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-09-09 Online:2014-11-30 Published:2014-11-30
Contact: Song Xing-hua, M.D., Doctoral supervisor, Chief physician, Departmenet of Bone Tumor, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Yang Bei-bei, Studying for master’s degree, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81160218/H0605

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床研究表明，早期使用甲基强的松龙可以促进损伤神经功能恢复，合理的初始剂量、剂量间隔时间和治疗持续时间是甲基强的松龙治疗急性脊髓损伤取得良好效果的关键。

目的：观察急性脊髓损伤模型大鼠鞘内注射大剂量甲基强的松龙后的脊髓组织差异蛋白表达质谱。

方法：取8只SD大鼠，建立急性脊髓损伤模型，随机分2组，分别于造模后0，8 h鞘内注射甲基强的松龙7.5 mg/kg，于注射24 h后取损伤段脊髓组织，采用同位素标记相对和绝对定量技术分析两组差异蛋白质及表达明显相关神经再生的差异蛋白。

结果与结论：共鉴定到了87个差异表达的蛋白，与0 h组相比，8 h组上调的差异蛋白有43个，下调的差异蛋白数是44个。相关神经再生的差异蛋白18个，上调的差异蛋白有8个，下调的差异蛋白数是10个，其中OMgp是一个潜在的神经轴突生长抑制因子，OMgp与NgR/P75/TROY/Lingo-1组成受体复合体特异性结合，通过第二信使cAMP激活RhoA作用可抑制轴突生长锥的崩解。提示鉴定鞘内注射甲基强的松龙治疗大鼠急性脊髓损伤后脊髓差异蛋白和脊髓相关神经再生因子，分别进行蛋白数据库检索和功能分析，其表达可能作为急性脊髓损伤后临床上监测神经损伤再生的指标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织工程, 急性脊髓损伤, 鞘内注射, 神经再生, 蛋白质组学, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Clinical studies have shown that early use of methylprednisolone can promote neurological functional recovery, reasonable initial dose, interval time and treatment duration are the key to the methylprednisolone treatment of acute spinal cord injury.

OBJECTIVE: To observe the differential protein expression profile in spinal cord tissue after intrathecal injection of high-dose methylprednisolone was given in rat model of acute spinal cord injury.

METHODS: Eight Sprague-Dawley rats were included in this study to establish acute spinal cord injury model and the models were randomly divided into two groups, receiving intrathecal injection of methylprednisolone

7.5 mg/kg at 0 and 8 hours after modeling. The injured spinal cord tissue was harvested after 24 hours of injection. The differentially expressed proteins and nerve regeneration-related differential proteins in two groups were analyzed using isotope labeling and quantitative technical analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: Totally 87 differentially expressed proteins were identified in this study. Compared with 0 hour group, there were 43 up-regulated differential proteins and 44 down-regulated differential proteins in the 8-hour group. Eighteen differential proteins were related to neural regeneration, including 8 up-regulation proteins and 10 down-regulation proteins. OMgp as a potential neural axon growth inhibitory factor specifically bound with NgR/P75/TROY/Lingo-1 to form receptor complexes and activated RhoA through the second messenger cAMP, thus inhibiting the collapse of axon growth cone. Following intrathecal injection of methylprednisolone for treatment of acute spinal cord injury in rats, differential proteins and nerve regeneration-related factors in spinal cord are identified and analyzed for protein database retrieval and protein function analysis, their expression may serve as the indicator of monitoring nerve regeneration after acute spinal cord injury.

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Key words: spinal cord injury, injections, spinal, proteomics

中图分类号:

R318

杨贝贝，陈江涛，宋兴华. 脊髓损伤模型大鼠鞘内注射甲基强的松龙后的蛋白质组学变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(49): 7897-7902.

Yang Bei-bei, Chen Jiang-tao, Song Xing-hua. Proteome changes in a rat model of spinal cord injury after intrathecal injection of methylprednisolone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(49): 7897-7902.

图/表（结果） 2

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引言

由于交通、建筑及工业的发展，急性脊髓损伤患者每年都在增加，据估计全球现有约200万脊髓损伤患者，每年新发生近13万例。成年哺乳动物中枢神经系统损伤后自身再生能力非常有限，因此，脊髓损伤是灾难性疾病，给家庭和社会带来严重负担^[1]。从病理方面可将急性脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤，前者指外力直接或间接作用于脊髓所造成的机械性损伤，导致损伤处细胞快速死亡，为不可逆改变；后者为脊髓损伤后发生的一系列生化改变所致的细胞死亡，具有可逆性^[2]。随着研究的进展，人们对脊髓损伤的发病机制认识不断提高，目前已发现多种因素参与继发性脊髓损伤，但对急性脊髓损伤后的治疗时间窗无明显突破。国内外研究发现急性脊髓损伤损伤后6-8 h内对其进行及时有效的治疗，能明显改善急性脊髓损伤患者的运动、感觉功能，但迄今为止临床上急性脊髓损伤损伤修复尚缺乏切实有效的治疗手段^[3]。

最引人注目的是1990年第二次(美国)全国急性脊髓损伤研究(NASCISⅡ)结果的发表，在伤后8 h内应用甲基强的松龙30 mg/kg静脉内快速冲击，继之以5.4 mg/(kg·h)维持24 h，能明显改善急性脊髓损伤患者的运动、感觉功能^[4]。这可以说是针对脊髓创伤后继发性损伤进行治疗的二级干预研究的重要里程碑，它使得脊髓损伤后神经功能大多预后不良的状况得到了改善。临床研究表明，早期使用甲基强的松龙可以促进神经功能恢复^[5]，合理的初始剂量、剂量间隔时间和治疗持续时间是甲基强的松龙治疗急性脊髓损伤取得良好效果的关键^[6]。但相关研究发现甲基强的松龙在脊髓损伤8 h后应用，无论剂量大小对神经组织均无保护作用^[7-9]。这可能是由于脊髓损伤后损伤部位进行性血流减少，导致甲基强的松龙摄取量在脊髓损伤后随时间延长而下降，或缺血和组织变性在脊髓损伤后迅速发展，不能为甲基强的松龙所逆转而导致。多研究中心在应用大剂量甲基强的松龙冲击治疗急性脊髓损伤的疗效观察时发现，在时效方面要求8 h内应用甲基强的松龙，这可能与甲基强的松龙阻止Ca²⁺回流，保护神经细胞生物膜的完整性有关^[10]，因此越早应用效果越佳；在疗程方面一般为24 h，最多不超过48 h。应用甲基强的松龙冲击治疗可使损伤脊髓功能恢复，但患者并发症明显增多^[12]，近年来对是否需要使用和使用方式、适用人群又有争论，有研究发现采用甲基强的松龙治疗后并发症增加^[7^，^11]。由于此药物的不良反应，最近几年应用大剂量甲基强的松龙受到质疑^[12]。使用大剂量甲基强的松龙如同一把“双刃剑”，糖皮质激素介导的不良反应如感染、糖尿病合并症、切口延期愈合、感染、压疮、消化道出血、深静脉血栓等，有可能抵消其神经保护作用^[13-15]。

已有实验证明鞘内注射甲基强的松龙(6 mg/kg)能改善脊髓损伤预后^[16]，本实验取大剂量甲基强的松龙 (7.5 mg/kg)分别于急性脊髓损伤后0，8 h鞘内注射，治疗24 h后取脊髓组织做蛋白质谱分析，找出差异蛋白及表达明显相关神经再生的差异蛋白，为从分子水平治疗急性脊髓损伤后神经再生奠定理论基础。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年5至12月新疆医科大学第一附属医院实验动物中心完成。

材料：

实验动物：选用新疆医科大学第一附属医院实验动物中心(许可证编号SCXK(新)2011- 0004)提供的2月龄雄性SD大鼠8只，体质量250-350 g(平均300 g)。动物实验方法符合动物伦理学要求(伦理审批号20120220005)。

实验方法：

动物实验分组及模型建立：将8只2月龄雄性SD大鼠随机均分2组，即脊髓损伤0 h组、脊髓损伤后8 h组，参照Allen’s方法建立大鼠急性脊髓损伤模型。大鼠脊髓损伤撞击装置及脊髓损伤动物模型制作：后正中切口，切除T₉棘突、部分T₁₀棘突和部分椎板，暴露硬膜，质量为10 g的铁锤从25 mm高处自由落下，撞击硬膜囊，撞击能量为 25 mm×10 g，损伤直径为2.5 mm。

样品制备：脊髓损伤造模完成后，分别于损伤后0，8 h鞘内注射大剂量甲基强的松龙(7.5 mg/kg)，于治疗24 h后截取损伤脊髓段(以脊髓损伤为中心长度为1 cm，约500 mg)组织块，用生理盐水冲洗干净并清除脊髓硬脊膜，称质量后置入2 mL速冻管中并做好相应标记，先用液氮快速冷冻，然后置入-80 ℃深低温冰箱保存备用。

样本检测：

从样品中提取蛋白：称取适量的样品加入500 μL蛋白裂解液溶解后，分别添加终浓度为1 mmol/L的PMSF、 2 mmol/L的EDTA，5 min后添加终浓度10 mmol/L的 DTT；超声15 min后，25 000×g离心20 min，取上清；上清液在56 ℃条件下加入终浓度10 mmol/L DTT处理 1 h，还原打开二硫键；加入终浓度5 mmol/L IAM暗室静置45 min，进行半胱氨酸的烷基化封闭；加入适量冷丙酮，在-20 ℃静置2 h；再次25 000×g离心20 min，丢弃上清液；沉淀在200 μL 0.5 mol/L TEAB中超声溶解15 min；最后25 000×g离心20 min后取上清液用于定量。

蛋白质浓度测量(Bradford定量)：准备BSA标准品的标准曲线，9管的标准品量(0.2g/L BSA)依次为0，2，4，6，8，10，12，16，20 μL，向每管添加纯水，使最终体积为20 μL。管1是不含蛋白的参照，其他管分别含有0.4，0.8，1.2，1.6，2，2.4，3.2，4 μg蛋白。向每管添加180 μL protein assay reagent，混合，室温培养10 min后；用酶标仪测量595 nm下的吸光度，以管1作参照物，读出每个样品的吸收率。

SDS电泳：配置12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶。每个样品分别与2×loading buffer混合，95 ℃加热5 min。每个样品上样量为30 μg，Marker上样量10 μg。120 V恒压电泳120 min。电泳结束后，考染液染色2 h，再用脱色液脱色3-5次，每次30min。

蛋白质酶解：每个样品精确取出100 μg蛋白后；按蛋白∶酶=20∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h后；按上述比例再补加Trypsin一次，37 ℃继续酶解8 h。

iTRAQ标记：胰蛋白酶消化后，用真空离心泵抽干肽段；再用0.5 mol/L TEAB复溶肽段，按照手册进行iTRAQ标记后；每一组肽段被不同的iTRAQ标签标记，室温培养2 h；再将标记后的各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。

SCX分离：采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4.6×250 mm型号的UltremexSCX柱对样品进行液相分离。将标记后抽干的混合肽段用4 mL bufferA(25 mmol/L NaH₂PO₄in 25% ACN，pH 2.7)复溶。进柱后以1 mL/min的速率进行梯度洗脱：先用buffer A洗脱10 min ，接着逐渐混入5%-35% buffer B(25 mmol/L NaH₂PO₄，1 mol/L KCl in25%ACN，pH 2.7)洗脱11 min，最后逐渐混入35%- 80% bufferB洗脱1 min。整个洗脱过程在214 nm吸光度下进行监测，经过筛选得到20个组分。每个组分分别用StrataX除盐柱除盐，然后冷冻抽干。

基于TripleTOF5600的LC-ESI-MSMS分析：与质谱仪相结合的液相系统为nanoACQuity(Waters)，包括Symmetry C18柱(规格5 μm，180 μm×20 mm)和BEH130C18柱8/32(规格1.7 μm，100 μm×100 mm)两部分。SymmetryC18柱用于肽段吸附和除盐，BEH130C18柱用于分离。所用的流动相A液(水∶乙腈∶甲酸=98∶2∶0.1)和B液(水∶乙腈∶甲酸=2∶98∶0.1)中都加入一定比例的校正液(ThermoFisherScientific)。每次上样量为2.25 μg (9 μL)，用A液以2 μL/min流速洗脱15 min，进行肽段吸附和除盐。接下来用含5%B液的流动相以300 nL/min流速洗脱 1 min开始建立洗脱梯度：40 min B液梯度线型从5%升至35%，再5 min从35%升至80%，然后80%持续洗脱5 min，最后2 min恢复柱料。使用的机器为TripleTOF5600(AB SCIEX，Concord，ON)，离子源为Nanospray Ⅲ source (AB SCIEX，Concord，ON)，放射器为石英材料拉制的喷针(New Objectives,Woburn,MA)。数据采集时，机器的参数设置如下：离子源喷雾电压2.5 kV，氮气压力为30 psi (14.5 psi≈0.1 MPa)，喷雾气压15 psi，喷雾接口处温度 150 ℃；扫描模式为反射模式，分辨率≥30 000；积累 250 ms的从2+到5+的离子挑选其中强度每秒积累超过120分的前30个进行扫描，3.3 s为一个循环；第二个四极杆(Q2)的传输窗口设置为100 Da为100%；脉冲射频电的频率为11kHz；检测器的检测频率为40 GHz；每次扫描的粒子信号以4个通道分别记录共4次后合并转化成数据；对于iTRAQ类项目，离子碎裂的能量设置为(35±5) eV；母离子动态排除设置为：在一半的出峰时间内(约18s)，相同母离子的碎裂不超过2次。

主要观察指标：两组差异蛋白质及表达明显相关神经再生的差异蛋白。

统计学分析：经检测得到的原始质谱数据与“IPI大鼠蛋白数据库”比对找出蛋白序列号，然后通过Mascot蛋白质鉴定软件找出具体的蛋白。IPI大鼠蛋白数据库是由EBI(欧洲生物信息研究所，全称EMBL-European BioinformaticsInstitute)负责维护的蛋白数据库之一。Mascot是一个蛋白质鉴定软件，曾被Frost/Sullivan研究机构评为生物质谱软件的黄金标准。该项目中使用的软件版本为Mascot 2.3.02。

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讨论

当今世界医疗水平蓬勃发展，但脊髓损伤仍是摆在人类面前的难题，急性脊髓损伤分为原发性和继发性两大类，原发性损伤是指受伤时由于脊柱骨折的移位、脱位引起脊髓压迫、冲击、撕裂，在受伤的一瞬间由外力产生的不可逆损伤；继发性损伤是脊髓原发性损伤之后，由于各种因素引起的脊髓再损伤，即脊髓损伤后发生局部出血、炎性反应、微循环障碍、局部组织自由基产生等一系列继发损伤，其所导致的脊髓损害远远超过原发性损伤^[17]。

目前针对急性脊髓损伤后炎症相关蛋白已有大量报道^[18-19]，本实验从分子水平寻找相关神经再生因子差异蛋白，力求从分子水平促进神经再生，改善急性脊髓损伤后患者运动、感觉功能。实验建立SD大鼠急性脊髓损伤，分别于0，8 h鞘内注射甲基强的松龙，于治疗24 h后取脊髓组织，应用iTRAQ技术分析脊髓组织的差异蛋白质。实验中，C-0_121-VS-C-8_118脊髓损伤组织中相关神经再生的差异蛋白18个，上调的差异蛋白有8个，下调的差异蛋白数有10个。其中突触前膜上的突触小体相关蛋白(Synaptosomal-associated protein 25，SNAP-25)是一个多功能蛋白，不仅在轴突的生长、形成、小泡与质膜的融合过程中起着重要的作用，而且参与调控神经元兴奋性^[20]。Neuroplastin是免疫球蛋白超家族中的一种细胞黏附分子，有2种亚型：neuroplastin 65和neuroplastin 55。Neumplastin在神经系统发育过程中，对于神经突起、突触形成等都有重要作用，但其确切机制尚未完全明确，可能通过亲同性结合或亲异性结合后，诱导神经突起生长和促进神经元存活^[21-22]。

微管相关蛋白2是一种热稳定的磷蛋白，属于结构性微管相关蛋白家族，是微管间桥的主要成分，主要存在于神经元胞体的树突和轴突，微管相关蛋白2可与微管连接促进它的稳定，并可能参与神经元的发育、结构稳定、突起形成及突触可塑性的调节。微管相关蛋白2还与突触后膜骨架上一些信号蛋白和膜受体相连，是许多神经信号传导通路的底物，调节神经元突触可塑性以及细胞骨架动力学，这对于神经功能是必须的。不同损害均会改变微管相关蛋白2的磷酸化状态及其对蛋白水解的敏感性，引发神经元结构的变化^[23]，在某些情况下，微管相关蛋白2在损害后细胞恢复中起重要作用。而长期的慢性损害引起不可逆的微管相关蛋白2和其他微管相关蛋白的改变，导致神经元的功能丧失和死亡，因此微管相关蛋白2在神经元与轴突的再生中发挥重要作用^[24]。

目前大多数学者认为中枢神经系统损伤后轴突再生相当困难，其原因可能与胶质疤痕的抑制作用除通过机械屏障限制神经再生外，其组成细胞自身还能分泌许多轴突生长抑制分子抑制神经再生，同时微环境中抑制子发挥抑制作用有关^[25-26]。现在已确定的轴突抑制因子有髓鞘相关蛋白、勿动蛋白和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白。作为NgR配体家族的第3个成员，少突胶质细胞髓鞘糖蛋白位于髓鞘及少突胶质细胞的外表面，是中枢神经系统白纸内多肽合成的特异性糖蛋白，它是一个潜在的神经轴突生长抑制因子。Chivatakarn等^[27]研究指出，NgR在有少突胶质细胞髓鞘糖蛋白介导的轴突生长抑制作用中不可或缺。NgR在中枢神经系统中分布广泛，外周组织中只是心脏和肾脏有极少量分布。NgR作为Nogo、髓鞘相关蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白的共同受体，介导三者轴突再生的抑制作用，其作为配基和信号传递与调节功能域已基本明确。少突胶质细胞髓鞘糖蛋白通过与NgR/P75/TROY/Lingo-1组成受体复合体特异性结合，通过第二信使cAMP激活RhoA作用，可抑制轴突生长锥的崩解^[28-30]。

研究人员通过对发育期啮齿类动物中枢神经系统表达少突胶质细胞髓鞘糖蛋白 mRNA的分析，动物出生后少突胶质细胞髓鞘糖蛋白都有一定程度的增加，这可能与中枢神经系统区域发育成熟密切相关。Ji等^[31]通过建立脊髓损伤模型，观察到少突胶质细胞髓鞘糖蛋白在急性脊髓损伤后表达显著增高，断裂的轴突再生缓慢；而少突胶质细胞髓鞘糖蛋白基因剔除大鼠脊髓损伤后，断裂的轴突可延伸到远端脊髓，而且功能恢复也很理想。提示少突胶质细胞髓鞘糖蛋白对神经再生与修复发挥抑制作用。

本实验中脊髓损伤8 h组比脊髓损伤0 h组中的少突胶质细胞髓鞘糖蛋白表达显著下调，差异有显著性意义(P < 0.05)。通过GO分析，少突胶质细胞髓鞘糖蛋白与神经再生的生物学功能密切相关，其参与的分子生物学功能：抗细胞增殖、诱发细胞生长抑制、参与神经生长因子受体信号通路、轴突的生成、中枢神经系统髓鞘生成、细胞黏附等。实验证明鞘内注射甲基强的松龙后少突胶质细胞髓鞘糖蛋白的表达下调，甲基强的松龙通过抑制少突胶质细胞髓鞘糖蛋白的表达，进而发挥保护脊髓的作用。随着对少突胶质细胞髓鞘糖蛋白及NgR的不断研究深入，人们似乎看到了急性脊髓损伤后神经再生的希望，通过应用少突胶质细胞髓鞘糖蛋白受体拮抗剂及阻断下游信号传导来干预神经损伤过程，以达到促进神经再生修复的目的。但这只是一个起点，关于少突胶质细胞髓鞘糖蛋白目前还有很多未知，且影响急性脊髓损伤后神经再生的因素众多，仍需进一步深入研究。

实验中可能影响结果的因素：实验样本数量少，可能需大量样本进一步验证；仅对比0，8 h时间点的差异蛋白，而未能进行多时间点差异蛋白对比，不能阐明差异蛋白的动态变化；文中差异蛋白丰度比值低，对临床指导意义待定。

基于iTRAQ技术对蛋白组学的研究，为研究神经系统损伤性疾病提供了广泛而实用的生物学信息。实验中检测到多种差异蛋白，从众多蛋白中找出相关神经再生的差异蛋白，它们可能过作为急性脊髓损伤的生物标记物或临床监测神经损伤修复过程的指标，亦可从分子水平治疗急性脊髓损伤寻找新思路，建立治疗急性脊髓损伤安全、快捷、有效、经济的新方法。文章对鞘内注射甲基强的松龙治疗急性脊髓损伤后，相关神经再生的差异蛋白进行初步研究，差异蛋白对急性脊髓损伤后神经再生及保护功能的机制未得到明确证实，鞘内注射甲基强的松龙的时间及差异蛋白动态变化对神经再生的影响需进一步研究。

脊髓损伤模型大鼠鞘内注射甲基强的松龙后的蛋白质组学变化

Proteome changes in a rat model of spinal cord injury after intrathecal injection of methylprednisolone

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